Михаил Викторович Скапцов, к. б. н., старший научный сотрудник Южно-Сибирского ботанического сада АлтГУ, рассказывает об уникальных исследованиях в области цитометрии растений – высокопроизводительном методе быстрого анализа физических и химических свойств изолированных ядер клеток (плоидности, размера генома) в жидком потоке с помощью лазеров.
Основной фокус работы Южно-Сибирского ботанического сада – исследование диких и краснокнижных видов растений, изучение их молекулярно-генетических и цитогенетических характеристик. Ведутся работы и в области биогеографии и распространения растений, в том числе в контексте климатических изменений. Но это направление сопутствующее.
– Наша лаборатория – первая в России узкоспециализированная лаборатория, которая целенаправленно работает с цитометрией растений. Мы начали масштабно заниматься растительным материалом раньше других. Если до этого цитометрию применяли к растениям эпизодически – как один из методов для получения отдельных результатов, то мы изначально выстроили работу именно по этому направлению. В нашей работе активно используются методы ПЦР-анализа, клонирования (амплификации) ДНК и другие молекулярные способы преимущественно в области филогенетики растений. Поскольку большинство сотрудников так или иначе работают с ПЦР-анализом, мы не ограничиваемся исключительно растениями: сам метод широко применим и к животным клеткам, и к человеческой ДНК. Поэтому при наличии заинтересованных заказчиков можем работать и в этом направлении. Например, разрабатывать тест-системы. Ранее мы также занимались генетической паспортизацией растений, – объясняет Михаил Скапцов.
За годы работы лаборатория Южно-Сибирского ботанического сада накопила обширный опыт работы с растительным материалом, который сам по себе достаточно сложный объект исследования. Как уточняет Михаил Викторович, в ряде случаев достаточно просто измельчить образцы, выделить ядра и сразу получить корректный результат, однако это скорее редкость. Чаще всего, особенно при работе со сложными группами растений, такими как суккуленты или виды с выраженной пигментацией, приходится дополнительно оптимизировать методику: в таких тканях содержатся полисахариды и другие соединения, которые мешают анализу, в том числе регистрации флуоресценции и связыванию красителя. Но благодаря накопленным знаниям удалось решить большинство методических проблем, с которыми сталкиваются лаборатории, только начинающие работать с растительной цитометрией. Нередко такие лаборатории, когда приобретают оборудование, впервые сталкиваются с этим методом и не понимают, как интерпретировать полученные пики, где находится стандарт, что делать в случае некорректного результата, как изменить протокол и правильно пересчитать данные.
– Поэтому около пяти лет назад лаборатория Южно-Сибирского ботанического сада провела первую школу по растительной цитометрии. На обучение приезжали специалисты практически из всех регионов России – как из университетов, так и из институтов Российской академии наук. Участники представляли самые разные направления: физиологию, генетику, биохимию, ботанику, эволюционную биологию. В рамках школы и консультаций мы подробно разбираем типичные ошибки и основные проблемы, возникающие при работе с методом. Мне регулярно пишут и обращаются за консультациями по выбору оборудования: какой прибор подойдет для работы с растительными клетками, а какие системы ориентированы исключительно на животные клетки и для растений не подходят. Это связано с тем, что изначально проточная цитометрия развивалась именно как метод исследования животных клеток. Также часто задают вопросы, каким оборудованием мы пользуемся и в чем преимущества исследовательских приборов по сравнению с более простыми и устаревшими моделями, – акцентирует внимание Михаил Скапцов.
Современные приборы позволяют использовать комбинированный подход, объединяющий проточную цитометрию и цитометрию изображений. Это означает, что каждое ядро или сама клетка, проходящие через капилляр, могут быть не только зарегистрированы по сигналу, но и визуализированы. Можно увидеть, что именно находится в конкретном пике: полноценное ядро, обломок клетки, слипшиеся клетки или бактерия.
Одна из распространенных проблем заключается в образовании дублетов – сдвоенных событий, когда две клетки или ядра слипаются и дают сигнал, вдвое превышающий нормальный. Такой сигнал можно ошибочно интерпретировать как объект с увеличенным содержанием ДНК. При визуальном же контроле дублет легко распознать и исключить из анализа. В классической проточной цитометрии это тоже возможно, но требует использования нескольких параметров одновременно и определенного опыта, чтобы корректно отделить синглеты от дублетов.
– Эти методические тонкости обычно неочевидны для начинающих специалистов. Основная литература по теме – англоязычная и, как правило, не содержит подробных практических разъяснений: чаще всего в публикациях просто указывается, что метод применен и использован тот или иной краситель, без детального описания интерпретации результатов. Все эти знания мы накапливали на основе собственного опыта и собственных ошибок и именно поэтому делимся ими с коллегами. Фактически школа растительной цитометрии в России была сформирована нами.
Акцент
Цитометрия растений используется в самых различных областях биологии. Метод позволяет с высокой точностью измерять размер генома и определять уровень плоидности растений. Эти данные позволяют различать близкие виды, выявлять полиплоидные комплексы, изучать процессы гибридизации и видообразования в целом. С точки зрения физиологии и биохимии метод незаменим для изучения регуляции клеточного цикла, эндоредупликации, открывает возможности для изучения влияния факторов среды на растительный организм.
Цитометрия нашла широкое прикладное применение в биотехнологии, генетике и селекции растений. Метод используется для раннего скрининга плоидности гибридов, контроля стабильности сортов in vitro, отбора необходимых цитотипов, создании дигаплоидных культур, оценки посевного материала, а также для контроля генетической чистоты и устойчивости ценных линий растений.
Софья ПРОТАСОВА
Фото Дмитрия ГЕРАЙКИНА
